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1.熒光基礎(chǔ)知識

在顯微成像中，熒光指的是一種光致發(fā)光現(xiàn)象，某些分子能吸收特定波長的光線，然后再發(fā)射出其他波長的光線的物理現(xiàn)象，這種分子一般稱為熒光團(tuán)。通常情況下，由于斯托克斯位移，熒光團(tuán)的最大激發(fā)和發(fā)射光譜之間存在差值，發(fā)射光線能量低于吸收光線，波長比激發(fā)光更長。
熒光現(xiàn)象有兩種：自發(fā)熒光與繼發(fā)熒光。自發(fā)熒光也稱固有熒光，是指經(jīng)照射后就能發(fā)出熒光；繼發(fā)熒光也稱二次熒光，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱熒光，需先用熒光染料標(biāo)記處理，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。目前在熒光顯微技術(shù)中，主要利用的是繼發(fā)熒光現(xiàn)象。

念珠藻葉綠體的自發(fā)熒光，明美MF52-N拍攝

熒光產(chǎn)生包含激發(fā)和發(fā)射兩個過程，在熒光顯微技術(shù)中具體體現(xiàn)為以下幾個關(guān)鍵部件：（1）激發(fā)光源：主要包含以下兩個指標(biāo)

• 光源光譜覆蓋發(fā)射光譜：熒光團(tuán)在特定波段范圍才能被好的激發(fā)，因此激發(fā)光源的光譜范圍要能匹配所觀察樣本中的熒光團(tuán)激發(fā)特征。
  

• 發(fā)射光譜波段的強(qiáng)度：熒光信號一般較弱，需要使用較高亮度的激發(fā)光以產(chǎn)生較強(qiáng)信號的發(fā)射熒光信號。

明美-四通道LED光源MG120，寬光譜 + 高光功

（2）激發(fā)塊：用于形成特異性激發(fā)/發(fā)射的一組濾光片，一般包含以下三個

• 激發(fā)濾光片EX：濾過光源中特定波段的光，用以激發(fā)樣本中特定染料

• 發(fā)射濾光片EM：允許熒光團(tuán)發(fā)射的特定波段的光通過

•  二向分色鏡DM：反射激發(fā)波段的光，透過發(fā)射波段的光。透射熒光顯微鏡沒有這個濾光片，但目前主流都是落射熒光顯微鏡，會有二向分光鏡。

明美可定制適配四大各品牌，不同波段需求的激發(fā)塊

2.熒光顯微成像的應(yīng)用

熒光顯微鏡利用自發(fā)熒光或繼發(fā)熒光現(xiàn)象，廣泛用于生物（醫(yī)學(xué)）、礦物、材料科學(xué)等領(lǐng)域的顯微熒光觀測。①在生物學(xué)領(lǐng)域，主要借助熒光染料標(biāo)記，可準(zhǔn)確和詳細(xì)地識別細(xì)胞和亞微觀細(xì)胞成分。②在礦物學(xué)領(lǐng)域，通常用于研究有自發(fā)熒光特性的物質(zhì)，如石油、煤炭、氧化石墨烯等礦物。③在材料科學(xué)，可用于紡織工業(yè)或造紙業(yè)來分析基于纖維的材料，包括紡織品和紙張，在半導(dǎo)體領(lǐng)域，也可用來觀測具有熒光特性的材料如磁珠等。

明美MF31-LED熒光顯微鏡觀察SBS改性瀝青

MF43-N拍攝的磁珠熒光圖片

熒光顯微技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用是非常廣泛也是最復(fù)雜的，主要是對細(xì)菌、細(xì)胞、組織或小型生物（如斑馬魚等模式生物）進(jìn)行標(biāo)記成像，它的微觀層面都是通過熒光染料對分子層面進(jìn)行標(biāo)記。從熒光染料的選擇看，通常需要考慮幾個因素，一是熒光染料標(biāo)記的位置，二是該染料對應(yīng)的激發(fā)特征，包括吸收光譜特征和發(fā)射光譜特征。借助熒光染料，熒光顯微技術(shù)不只局限于蛋白質(zhì)，它還可以對核酸、聚糖進(jìn)行染色，甚至鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測。以下根據(jù)染料結(jié)合的位置列舉了一些常見的熒光染料及應(yīng)用范圍：

FITC熒光染色，MF52-N拍攝

（1）免疫熒光（IF）：主要標(biāo)記的是蛋白質(zhì)。免疫熒光技術(shù)利用抗體可以和相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的特性，主要有兩種方式：一是利用內(nèi)源熒光信號，即通過克隆技術(shù)用遺傳學(xué)方法將熒光蛋白與目的蛋白相連，如GFP等；二是利用熒光標(biāo)記的抗體與目的蛋白特異性結(jié)合。

• FITC（異硫氰酸熒光素）：是一種有機(jī)熒光染料，495/517 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可以和蛋白質(zhì)上的基團(tuán)結(jié)合，主要用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。

• TRITC（四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸）：屬于羅丹明家族的衍生物，550/573 nm為該染料激發(fā)/發(fā)射峰值，可與蛋白質(zhì)結(jié)合。

• 花箐染料（cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7等系列）：非特異性吸附少，消光系數(shù)高，熒光量子產(chǎn)率高，從而讓標(biāo)記顯影時(shí)背景弱，信號強(qiáng)。除細(xì)胞顯影外，它們也常用于生物篩選、蛋白免疫印跡、生物醫(yī)學(xué)顯影、小動物體內(nèi)成像等。

• Alexa Fluor系列：屬于帶負(fù)電荷且親水的熒光染料系列，是不同基礎(chǔ)熒光物質(zhì)的磺化形式。這些產(chǎn)品標(biāo)識涵蓋了對應(yīng)的激發(fā)波長，相比于FITC等染料，具有更好的穩(wěn)定性和熒光亮度。

DAPI熒光染色，MF52-N拍攝

（2）DNA染色：主要標(biāo)記核酸。同蛋白質(zhì)一樣，對核酸進(jìn)行標(biāo)記與研究同樣有重要意義，如對細(xì)胞核（主要成分為核酸）進(jìn)行染色標(biāo)記可以判斷細(xì)胞的數(shù)量和位置。

• DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）：當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時(shí)，在358nm處有一個最大吸收峰，在461nm處有一個最大發(fā)射峰，其發(fā)射光的波長范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。DAPI也可與RNA結(jié)合，但產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度不及與DNA結(jié)合的結(jié)果。DAPI可以透過完整的細(xì)胞膜，因此被廣泛用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。

• Hoechst（33258、33342、34580）：這三種染料都可在350nm左右的紫外光激發(fā)，在461nm處發(fā)出藍(lán)靛色熒光。與DAPI類似，Hoechst可透過完整細(xì)胞膜，被廣泛用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞染色。

• PI（碘化丙啶）：是一種不能透過細(xì)胞膜的DNA染色劑。與核酸結(jié)合后，最大激發(fā)波長為538 nm，最大發(fā)射波長為617 nm。由于該染色劑無法進(jìn)入完整的細(xì)胞中，因此該染色劑常用于區(qū)分細(xì)胞群中的活細(xì)胞和死細(xì)胞。

Fura2鈣離子探針做的研究圖片， 引自公開文獻(xiàn)

Front. Neural Circuits 11:11. doi: 10.3389/fncir.2017.00011（3）離子成像：研究細(xì)胞中各種離子的流動與分布對細(xì)胞活動的深入理解有重要作用。通過各種離子指示劑，如鈣離子、鈉離子、鎂離子、鋅離子等指示劑與離子結(jié)合形成熒光團(tuán)，利用光譜特征檢測對應(yīng)離子的分布狀態(tài)。

3.熒光顯微成像的挑戰(zhàn)

應(yīng)用熒光顯微技術(shù)進(jìn)行成像的過程中，不僅要考慮成像的質(zhì)量，包括分辨率、對比度、熒光信號強(qiáng)弱、背景光、多通道成像等，還要考慮熒光染料、光照等對樣本的影響，比如熒光染料毒性、光毒性、光漂白等。以下列出了熒光顯微技術(shù)應(yīng)用中的常見挑戰(zhàn)與應(yīng)對方法：

汞燈需搭配帶計(jì)時(shí)器的復(fù)雜控制箱來使用

（1）激發(fā)光源選擇和使用。傳統(tǒng)熒光成像使用的是高壓汞燈，具有特異性的光譜特征和較高的光強(qiáng)，但使用有很多麻煩，首先需要預(yù)熱，然后光強(qiáng)靠ND濾鏡調(diào)節(jié)，最后壽命較短可能就200小時(shí)，在壽命用完前還會有光強(qiáng)衰減問題，需要調(diào)整ND濾鏡，替換燈泡后需要重新校中。目前很多應(yīng)用都用LED熒光光源取代汞燈作為熒光光源，如寬光譜大功率LED熒光光源MG-100，壽命長單個可以頂50個汞燈，光強(qiáng)更穩(wěn)定可控，并且可以即開即用，省事省心。

明美可定制適配四大各品牌的濾光片組

（2）濾光片質(zhì)量和匹配度。激發(fā)塊中的濾光片質(zhì)量會影響激發(fā)光和發(fā)射光的透過率，影響熒光效率并帶來雜散光和背景噪聲問題。同時(shí)，濾光片的參數(shù)能否匹配染料的激發(fā)峰和發(fā)射峰，也會對熒光效果產(chǎn)生重大影響。對于簡易熒光需求，明美建議使用數(shù)顯熒光模塊，整合光源和BGU等常用激發(fā)塊，可以為四大各品牌顯微鏡升級熒光觀察，簡單易用效果好。對于專業(yè)熒光需求，明美提供匹配四大各品牌主流熒光顯微鏡的激發(fā)盒和濾光片組，可按需定制不同濾光片組合，如鈣離子Fura2探針需要用U激發(fā)G發(fā)射，一般的U激發(fā)B發(fā)射濾光片組并不適合。

MF43-N+MC50-S拍攝的小鼠腦片熒光圖像

（3）光毒性與熒光染料毒性：在生物學(xué)領(lǐng)域的熒光成像中，需考慮光毒性與熒光染料毒性對樣本的影響，如細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)分子在與氧反應(yīng)時(shí)吸收光發(fā)生分解并產(chǎn)生自由基，部分熒光染料本身也能產(chǎn)生自由基，這是引起細(xì)胞等生物樣本損傷的主要來源。通常的應(yīng)對思路是：①使用具有較低能量（波長較長）激發(fā)光譜的熒光染料；②盡可能低的光強(qiáng)和盡可能短的激發(fā)時(shí)間，需要在成像質(zhì)量與樣本健康之間保持平衡；③降低幀速率，尤其在長時(shí)間的熒光成像中，這種情況需要提高相機(jī)的靈敏度，保證捕獲微弱的熒光信號。

單通道熒光拍攝，經(jīng)軟件合成多色熒光圖像

（4）多色熒光成像：在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多，尤其是在對活細(xì)胞標(biāo)記成像時(shí)，需同時(shí)對多種物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，并在一個圖像中顯示，而大多數(shù)熒光染料具有寬發(fā)射光譜，在使用多種染料標(biāo)記時(shí)會出現(xiàn)熒光光譜重疊現(xiàn)象。對于多色熒光成像，有兩種應(yīng)對思路，一是針對每種染料使用對應(yīng)的單通道窄帶濾光片，最后通過軟件進(jìn)行合成，這種方式對成像速度及軟件圖像處理提出較高要求；二是使用寬光譜光源同時(shí)激發(fā)，選用雙通濾光片或多通濾光片，這種濾光片的的特點(diǎn)是允許兩種或以上波段熒光信號通過，可實(shí)現(xiàn)一組濾光片同時(shí)觀察兩種或以上熒光染料，這種方式要求相鄰的發(fā)射光譜范圍沒有重疊，所得到的熒光信號之間能較好的被區(qū)分。

雙通濾光片熒光拍攝，鏡下可同時(shí)觀察到B\G兩種熒光信號

4.明美熒光顯微成像解決方案

（1）醫(yī)院真菌、婦科等常規(guī)熒光檢測推薦：MF23/MF31+普通顯微鏡相機(jī)MSX1/MC50-S/MS60/MD50等

• 數(shù)顯LED熒光模塊，可定制的單色或三色激發(fā)，推拉式切換，即開即用

•  高數(shù)值孔徑熒光物鏡，高清晰度與高熒光透過率

• 可拍攝數(shù)字圖片，方便出具報(bào)告，可合成多色熒光圖像

（2）高校、研究所等科研研究，醫(yī)院癌癥復(fù)核等高要求檢測推薦：MF53-N/MF43-N + MG100/MG120 + 高靈敏度相機(jī)MC50-S/MS23/MSH12

•  研究級熒光顯微鏡機(jī)身，具備更好的熒光效果和更強(qiáng)的擴(kuò)展性能，應(yīng)對各種需求

• 6孔轉(zhuǎn)盤式熒光附件，可按需自主選擇激發(fā)塊，實(shí)現(xiàn)對多種熒光染料觀測

• 可定制雙通等特殊濾光片組，實(shí)現(xiàn)更高效的FISH等觀察應(yīng)用需求

• LED激發(fā)光源，大功率寬光譜激發(fā)效果好，即開即用使用便捷，壽命長性價(jià)比高

• 高靈敏度相機(jī)，更高效實(shí)時(shí)反饋動態(tài)圖像，搭配軟件可實(shí)現(xiàn)FISH等應(yīng)用

（3）斑馬魚、果蠅、朱墨時(shí)序等宏觀熒光觀察推薦：MZX81/MZX100 + 普通顯微鏡相機(jī)MSX1/MC50-S/MS60/MD50等

• 高質(zhì)量平場(復(fù))消色差物鏡，獨(dú)立平行雙光路，大變倍比，成像效果好

• 數(shù)顯熒光模塊，可選BG等雙色激發(fā)，紫外單獨(dú)外置，減少對樣品和機(jī)內(nèi)鍍膜損害

• 廣泛應(yīng)用于斑馬魚、線蟲、果蠅、朱墨時(shí)序、新材料等領(lǐng)域，豐富經(jīng)驗(yàn)

（4）四大各品牌普通顯微鏡升級熒光觀察推薦：數(shù)顯熒光模塊，或批量定制熒光模塊

• 可適配四大各品牌大部分無限遠(yuǎn)光學(xué)顯微鏡，高性價(jià)比升級熒光觀察

• 數(shù)顯屏幕，直觀顯示當(dāng)前波段和亮度，方便定量分析

• 內(nèi)置LED熒光光源，可選單色或BGU等三色激發(fā)，可選電動切換或四色激發(fā)

（5）四大各品牌熒光顯微鏡升級LED熒光光源或定制熒光激發(fā)塊推薦：寬光譜大功率熒光光源MG-120，四通道光源MG-120

• 可匹配四大各品牌主流熒光顯微鏡，覆蓋可見光激發(fā)光譜，激發(fā)效果穩(wěn)定

• 觸屏控制器，直觀易用的操作體驗(yàn)，可加入人走燈滅等智能功能

• 壽命長，即開即用，1個LED光源頂50個汞燈，無需預(yù)熱

• 光強(qiáng)調(diào)節(jié)高度線性，MG-120支持軟件觸發(fā)和TTL電平脈沖模式觸發(fā)

明美是一家專注顯微成像產(chǎn)品研發(fā)與銷售的高新技術(shù)企業(yè)，是中國儀器儀表行業(yè)協(xié)會光學(xué)分會理事單位，醫(yī)療器械顯微鏡生產(chǎn)及經(jīng)營廠家。
公司一直堅(jiān)持誠信經(jīng)營，用心服務(wù)，提供顯微成像解決方案。為教育、科研、醫(yī)藥、工業(yè)檢測等廣大客戶提供高效、穩(wěn)定的產(chǎn)品與服務(wù)。
始終以客戶需求為中心，以品質(zhì)為根本，以創(chuàng)新為方向，推動顯微行業(yè)的數(shù)字化、電動化、智能化，為顯微領(lǐng)域的國產(chǎn)化進(jìn)程貢獻(xiàn)力量。